Spätestens Mitte des 16. Jahrhunderts konsolidierte sich die evangelisch-lutherische Kirchenordnung im Fürstentum Calenberg und damit auch im Stift in Wunstorf. Die letzte Äbtissin Magdalena von Chlum wurde 1558 abgesetzt. Dadurch endete die Eigenständigkeit des Stifts endgültig, da der Landesherr die Abtswürde von nun an für sich beanspruchte und auch die Stiftsgüter für seine eigenen Zwecke verwendete. Der Herzog verband den Besitz der Abtei dauerhaft mit dem der herzoglichen Kammer. 

In der Regierungszeit von Erich II. kam es zum Verkauf von Grundstücken aus dem Stiftsbesitz, was zu nachhaltigen finanziellen Problemen führte. Im Jahr 1570 starb die Dechantin Ilse von Halle, welche dem Konvent seit der Absetzung der letzten Äbtissin vorgestanden hatte, dies erschwerte eine Restaurierung des Stifts zusätzlich.

Erst 1584, nachdem das Fürstentum Calenberg nach dem Tod von Erich II. an Wolfenbüttel gefallen war, kam es zu einem langsamen Neuanfang für das Stift. 1585 wurde die Wolfenbütteler Kirchenordnung auch in Calenberg eingeführt, was eine Generalvisitation zur Folge hatte, welche die Notwendigkeit von Veränderungen feststellte. Im Mai 1598 wurde dann eine Ordnung erlassen welche für den baulichen, finanziellen und organisatorischen Wiederaufbau des Stifts sorgen sollte. Diese Ordnung konstituierte das Stift als Institution, welche den politischen Zwecken der Fürsten von Braunschweig-Wolfenbüttel diente. Der damalige Herzog Heinrich Julius sicherte sich die umfassende Herrschaft über das Stift. Im Vergleich zur frühmittelalterlichen Verfassung des Stifts übernahm er die Rechte und Aufgaben des Bischofs, Vogtes, der Äbtissin und des Königs zugleich. 

Die Stiftsdamen wählten aus ihren Reihen eine (Vize-)Dechantin als Vorsteherin. Dem Kanonikerstift (Mannsstift), stand der Stiftssenior vor. Später wurde das Amt des Stiftseinnehmers eingeführt, der den Stiftssenior von einfachen Verwaltungs- und Kassensachen entlastete. Das Amt des Stiftsseniors war lange Zeit mit dem des Superintendenten für Wunstorf und seit dem späten 16. Jahrhundert bis ins 18. Jahrhundert, häufig mit dem des Generalsuperintendenten für das Fürstentum Calenberg verbunden.