Friedrich Wilhelm heiratete am 14. Juni 1668 zum zweiten Mal. Seine neue Frau wurde Dorothea von Holstein-Glücksburg (1636–1689). Aus Angst vor dem Alleinsein und aus Sorge um das Wohl seiner noch jungen Kinder ging er diese Ehe so bald nach dem Tod seiner ersten Gattin Louise Henriette ein. Der Kurfürst und Dorothea, die Witwe des Herzogs Christian Ludwig von Braunschweig-Lüneburg (1622–1665), kannten sich bereits vor ihrer Eheschließung. Vor der Hochzeit musste Dorothea als Lutheranerin ein Bekenntnis zum Übertritt zur reformierten Konfession ablegen. Sie galt zeitlebens als eine in religiösen Fragen tolerante Landesherrin, was sie in der überwiegend lutherischen Bevölkerung von Kurbrandenburg beliebt machte.

Die energische und willensstarke Dorothea wurde für den Kurfürsten eine gleichberechtigte Lebenspartnerin und unverzichtbare Begleiterin. Sie stand stets an seiner Seite und gab ihm in Zeiten heftiger Stimmungsschwankungen und Krankheit Rückhalt und Geborgenheit. Sie folgte ihrem Ehemann auf Kriegsschauplätze und auf Reisen durch die Provinzen.

Dorothea gebar dem Kurfürsten sieben Kinder. Friedrich Wilhelm bemühte sich, für alle Söhne aus erster und zweiter Ehe zu sorgen, indem er ihnen in seinen Testamenten einzelne Landesteile als Sekundogenituren vermachen wollte. Nach dem Tod des Vaters fand jedoch sein Nachfolger Friedrich III./I. andere Mittel, seine Brüder standesgemäß zu versorgen und verhinderte somit die Teilung Kurbrandenburgs. Ein Jahr nach der Geburt ihres ersten Sohnes Philipp Wilhelm erwarb Dorothea 1670 das seit Längerem verpfändete Amt Schwedt Vierraden an der Oder mit Geldern aus ihrem Privatvermögen. Im Einvernehmen mit ihrem Gemahl errichtete sie hier zur Versorgung ihrer männlichen Nachkommenschaft die Markgrafschaft Brandenburg-Schwedt.

In Berlin und Umgebung lassen sich noch heute Spuren der Kurfürstin finden. Schloss Caputh bei Potsdam erwarb der Kurfürst 1671 und schenkte es seiner Gattin. Sie ließ diesen Landsitz nicht nur verschönern, sondern sorgte auch für einen wirtschaftlich einträglichen Gutsbetrieb. Die Dorotheenstadt, heute ein Teil des Bezirks Mitte, wurde nach der Kurfürstin benannt. Dorothea entwickelte auf eigene Kosten dieses damals noch aus Ackerflächen bestehende Gebiet vor den Festungsmauern Berlins und ließ dort Häuser für Handwerker und Hofangestellte bauen. Hier wohnten zahlreiche Hugenotten, deren Einwanderung nach Brandenburg von der Kurfürstin tatkräftig unterstützt worden war.

Das Kurfürstenpaar verbrachte sein letztes Lebensjahrzehnt vor allem in Potsdam. Nach dem Tod Friedrich Wilhelms im Jahr 1688 gehörten Dorothea das herrschaftliche Amt und die Stadt. Das Potsdamer Stadtschloss wurde jedoch nur für kurze Zeit ihr Witwensitz. Dorothea verstarb 1689 im Alter von 53 Jahren etwa ein Jahr nach dem Tod ihres Gatten.